Медуза — животное с «огоньком»

Долгие годы зелёный флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP) казался бесполезной биохимической диковинкой, но в 1990-е годы он стал ценнейшим инструментом в биологии. Эта уникальная натуральная молекула флуоресцирует не хуже синтетических красителей, но в отличие от них безвредна. 

Открытие зелёного флуоресцентного белка позволило учёным пристально следить за тем, что происходит в клетках живого организма. На снимке светятся бесплодные мыши, в организм которых внедрили сперматогониальные клетки — взрослые стволовые клетки, находящиеся в мужских половых железах. Эти клетки отличаются тем, что при созревании превращаются в клетки сперматозоида. Чтобы выделить их среди остальных была специально выведена генетически модифицированная линия мышей, у которой нужные клетки были помечены флуоресцентным маркером. Фото: University of Pennsylvania 

 

С помощью GFP можно увидеть, как клетка делится, как по нервному волокну пробегает импульс или как метастазы «расселяются» по телу лабораторного животного. Сегодня Нобелевскую премию по химии вручают трём учёным, работающим в США, за открытие и разработку этого белка.

Чтобы получить первую порцию нового белка, исследователи ловили медуз ручными сетями — закидывали невод, как старик из сказки Пушкина. Самое удивительное, что выделенный из этих медуз диковинный белок из медузы через несколько десятилетий стал настоящей «золотой рыбкой», которая выполняет самые заветные желания клеточных биологов.

Что такое GFP?

GFP принадлежит к самой большой и разнообразной группе молекул живых организмов, которые ответственны за многие биологические функции, — к белкам. Он действительно зелёного цвета, при том что большинство белков не окрашены (отсюда их название — белок).

Немногочисленные окрашенные белки обладают цветом благодаря наличию небелковых молекул — «довесков». Например, гемоглобин нашей крови состоит из небелковой красно-бурой молекулы гема и бесцветной белковой части — глобина. GFP — это чистый белок без «добавок»: молекула-цепочка, которая состоит из бесцветных «звеньев» — аминокислот. Но после синтеза происходит если не чудо, то, по крайней мере, фокус: цепочка сворачивается в «клубок», приобретая зелёную окраску и способность излучать свет.

 

Чтобы получить достаточную для исследований порцию светящегося вещества, Осаму Симомура и сотрудники его лаборатории наловили и переработали более девяти тысяч медуз. Фото ( Creative Commons license): Denise Allen

В клетках медузы GFP работает в «тандеме» с другим белком, который излучает синий свет. GFP поглощает этот свет и излучает зелёный. Зачем глубоководной медузе Aequorea victoria светиться зелёным светом, учёные до сих пор не поняли. Со светлячками всё просто: в брачный сезон самка зажигает «маяк» для самцов — эдакое брачное объявление: зелёная, рост 5 мм, ищу спутника жизни.

В случае медуз такое объяснение не подходит: они не могут активно передвигаться и противостоять течениям, так что если и подают друг другу сигналы, то сами же не в состоянии плыть «на огонёк».

Осаму Симомура: без труда не вытащишь медузу

Все началось в 1950-е годы, когда в США в морской лаборатории Friday Harbor Осаму Симомура (Osamu Shimomura) стал изучать глубоководную светящуюся медузу Aequorea victoria. Трудно представить более «праздное» научное любопытство: очкарикам стало интересно, почему светится в темноте морских глубин никому не известная студенистая тварь. Изучал бы яд медузы, и то было бы проще вообразить перспективу практического применения.

Оказалось, что ловить медуз промышленным тралом нельзя: они сильно травмируются, поэтому пришлось ловить их ручными сетями. Для облегчения «творческой» научной работы под руководством настырного японца сконструировали специальную машину для разделки медуз.

Но научное любопытство, помноженное на японскую дотошность, дало результаты. В 1962-м Симомура и коллеги опубликовали статью, в которой рассказали об открытии нового белка, получившего название GFP. Самое интересное, что Симомуру интересовал не GFP, а другой белок медузы — экворин. GFP открыли как «сопутствующий продукт». К 1979 году Симомура и коллеги детально охарактеризовали структуру GFP, которая была, конечно, интересной, но лишь для немногочисленных узких специалистов.

 

Осаму Симомура демонстрирует биолюминесцентные возможности морских рачков, собранных на японском побережье. 1956 год. Фото: Tom Kleindinst

Мартин Чалфи: медузный белок без медузы

Прорыв был сделан в конце 1980-х — начале 1990-х годов с ведущим участием Мартина Чалфи (Martin Chalfie) — второго из «троицы» нобелевских лауреатов. С помощью методов генной инженерии (которая сформировалась лет через 15–20 после открытия GFP), учёные научились вставлять ген GFP в бактерии, а затем и в сложные организмы, и заставили их синтезировать этот белок.

Раньше считалось, что для приобретения флуоресцентных свойств GFP требует уникального биохимического «окружения», которое существует в организме медузы. Чалфи доказал, что полноценный светящийся GFP может образовываться также в других организмах, достаточно единственного гена. Вот теперь этот белок был у учёных «под колпаком»: не на морских глубинах, а всегда под рукой и в неограниченных количествах. Открылись небывалые перспективы практического применения.

Генная инженерия позволяет вставлять ген GFP не просто «куда-нибудь», а присоединять к гену конкретного белка, который интересует исследователя. В результате этот белок синтезируется со светящейся меткой, что позволяет видеть под микроскопом именно его на фоне тысяч других белков клетки.

Революционность GFP в том, что он позволяет «маркировать» белок именно в живой клетке, и сама клетка его синтезирует, а в эру до GFP почти вся микроскопия делалась на «зафиксированных» препаратах. По сути, биохимики изучали «моментальные снимки» биологических процессов «по состоянию на момент смерти», предполагая, что в препарате всё осталось так, как было при жизни. Теперь появилась возможность пронаблюдать и записать на видео многие биологические процессы именно в живом организме.

На агаровой пластинке с помощью разноцветных флуоресцентных колоний бактерий можно рисовать картины. Фото: University of California, San Diego

Фруктовая лавка Роджера Циена

Третий нобелевский лауреат, в общем-то, ничего не «открыл». Вооружившись чужими знаниями о GFP и методами генетической инженерии, в лаборатории Роджера Циен (Цянь Юнцзянь, Roger Y. Tsien) учёные стали создавать «по образу и подобию» новые флуоресцентные белки, которые лучше соответствовали их нуждам. Были устранены существенные недостатки «натурального» GFP. В частности, белок из медузы ярко светится при облучении ультрафиолетом, а для изучения живых клеток гораздо лучше использовать видимый свет. Кроме того, «натуральный» белок — тетрамер (молекулы собираются по четыре). Представьте, что четыре шпиона (GFP) должны следить за четырьмя фигурантами («маркированные белки»), и при этом всё время держаться за руки.

Изменяя отдельные структурные элементы белка, Циен и его коллеги разработали модификации GFP, лишённые этих и ряда других недостатков. Именно их теперь используют учёные по всему миру. Кроме того, команда Циена создала целую «радугу» флуоресцентных белков: от синего до красно-фиолетового. Свои разноцветные белки Циен назвал

в честь фруктов

соответствующих цветов: mBanana, tdTomato, mStrawberry (клубника), mCherry (вишня), mPlum (слива) и так далее.

Циен сделал список своих разработок похожим на фруктовую лавку не только в целях популяризации. По его словам, как не бывает одного самого лучшего фрукта на все случаи, так не бывает одного самого лучшего флуоресцентного белка: для каждого конкретного случая надо выбирать «свой» белок (а выбирать теперь есть из чего). Арсенал разноцветных белков нужен, когда учёные хотят проследить одновременно за несколькими видами объектов в одной клетке (обычно так и бывает).

Новым шагом в дизайне флуоресцентных белков стало создание «фотоактивируемых» белков. Они не флуоресцируют (а значит, не видны под микроскопом), до тех пор, пока с помощью кратковременного облучения специально подобранным лазером их не «зажжёт» исследователь. Лазерный луч аналогичен функции выделения в компьютерных приложениях. Если учёного интересуют не все молекулы белка, а только в одном конкретном месте и начиная с определенного момента, то можно «выделить» эту область с помощью лазерного луча, а затем наблюдать, что происходит именно с этими молекулами. Например, можно «активировать» одну из десятков хромосом, а потом наблюдать, как она «путешествует» по клетке во время деления, и остальные хромосомы не будут путаться под ногами.

Сейчас ученые пошли ещё дальше: недавно созданы флуоресцентные белки-хамелеоны, которые после специального облучения меняют цвет, причём эти изменения обратимые: можно много раз «переключать» молекулу с одного цвета на другой. Это ещё больше расширяет возможности изучения процессов в живой клетке.

Благодаря разработкам последнего десятилетия, флуоресцентные белки стали одним из главных инструментов исследований клетки. Об одном только GFP или исследованиях с его применением уже опубликовано около семнадцати тысяч научных статей. В 2006 году в лаборатории Friday Harbor, где был открыт GFP, установили памятник, изображающий молекулу GFP, высотой 1,4 м, то есть примерно в сто миллионов раз больше оригинала.

GFP из медузы Aequorea — лучшее доказательство того, что человеку необходимо беречь разнообразие «бесполезных» видов диких животных. Каких-то двадцать лет назад никто не предположил бы, что экзотический белок никому не известной медузы станет главным инструментом клеточной биологии XXI века. Более ста миллионов лет эволюция создавала молекулу с уникальными свойствами, которую не смог бы сконструировать «на пустом месте» никакой учёный или компьютер. Каждый из сотен тысяч видов растений и животных синтезирует тысячи своих собственных биологических молекул, которые в подавляющем большинстве пока не изучены. Может быть, в этом огромном живом архиве есть многое из того, что когда-нибудь понадобится человечеству.

Артхимера крольчиха Альба — произведение трансгенного искусства. Фото: Eduardo Kac/Purdue University

Возрастающая доступность «высоких технологий» молекулярной биологии привела к тому, что светящиеся белки стали использовать не только в серьёзных исследованиях.

Зелёное флуоресцентное сало

12 января 2006 ученые из Тайваня объявили о создании трансгенных зелёных флуоресцентных свиней. Взрослые свиньи целиком светятся зелёным светом в темноте, а при дневном свете их кожа имеет зеленоватый оттенок, особенно это заметно на пятачке. Учёные гордятся, что все ткани организма синтезируют зелёный белок, при том что раньше удавалось заставить светиться только отдельные группы клеток в целом организме. Кроме свечения, свиньи ничем не отличаются от обычных. Учёные утверждают, что такие свиньи не только станут украшением к Хэллоуину, но и помогут в изучении стволовых клеток.

В 2000 году по заказу современного художника Эдуарда Каца (Eduardo Kac) один французский генетик «сделал» зелёную флуоресцентную крольчиху по кличке Альба. Опыт не имел никаких научных целей: Альба была «произведением искусства» художника Каца в придуманном им направлении — трансгенном искусстве. Крольчиха (простите, художественное произведение Каца) демонстрировалась на различных выставках, пресс-конференциях и других мероприятиях, которые привлекли большое внимание.

В 2002-м Альба неожиданно умерла, а вокруг несчастного зверька в прессе поднялся скандал из-за противоречий между учёным-исполнителем и художником-заказчиком. Защищая коллегу от нападок Каца, французские генетики, например, утверждали, что Альба на самом деле не такая зелёная и светящаяся, как выглядит на фотографиях. Но если речь идёт об искусстве, почему бы не приукрасить с помощью «Фотошопа»?

Генетическая инженерия человека противоречит медицинской этике, поэтому вряд ли флуоресцентные белки будут применяться в легальных медучреждениях для диагностики и подобных целей. Однако можно предположить, что новые возможности заинтересуют салоны красоты и другие менее контролируемые заведения. Представьте себе, например, натуральные ногти или губы (никаких лаков и помад!), которые меняют цвет в зависимости от освещения и даже светятся в темноте, если кому-то нравится… Или рисунок на коже, образованный собственными флуоресцентными клетками, который становится видимым, только если посветить специальной лампой, вместо татуировок, которые разглядывает каждый кому не лень, а удалить трудно.

С. Авилов

Источник